免疫療法是當(dāng)下腫瘤治療領(lǐng)域最具前景的發(fā)展方向之一。隨著PD-(L)1等免疫檢查點(diǎn)抑制劑應(yīng)用范圍逐漸擴(kuò)大，CAR-T療法研究不斷出現(xiàn)新的進(jìn)展，CAR-T療法作為有別于傳統(tǒng)藥物的“活藥”，不僅對(duì)復(fù)發(fā)、難治性腫瘤患者表現(xiàn)出了突破性療效，其生產(chǎn)體系和使用場(chǎng)景也有別于普通藥物。鑒于生物技術(shù)的快速發(fā)展，預(yù)計(jì)CAR-T療法將帶給人們更多驚喜。

CAR-T療法是什么

CAR-T（Chimeric antigen receptor T cell，嵌合抗原受體T細(xì)胞）療法是指通過(guò)基因修飾技術(shù)，將帶有特異性抗原識(shí)別結(jié)構(gòu)域及T細(xì)胞激活信號(hào)的遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)入T細(xì)胞，使T細(xì)胞直接與腫瘤細(xì)胞表面的特異性抗原相結(jié)合而被激活。T細(xì)胞被激活后，一方面通過(guò)釋放穿孔素、顆粒酶素B等直接殺傷腫瘤細(xì)胞；另一方面通過(guò)釋放細(xì)胞因子，募集人體內(nèi)源性免疫細(xì)胞來(lái)殺傷腫瘤細(xì)胞，以達(dá)到治療腫瘤的目的。同時(shí)，還可形成免疫記憶T細(xì)胞，從而獲得特異性的抗腫瘤長(zhǎng)效機(jī)制。

一個(gè)典型的CAR-T治療流程主要分為五個(gè)步驟：分離，從癌癥患者外周血中分離純化出自身T細(xì)胞；修飾，T細(xì)胞激活后，利用基因工程將能特異識(shí)別腫瘤細(xì)胞的CAR結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)入T細(xì)胞；擴(kuò)增，體外培養(yǎng)，大量擴(kuò)增CAR-T細(xì)胞至治療所需劑量，一般為十億至百億級(jí)別（根據(jù)患者體重和治療周期決定）；回輸，化療清淋預(yù)處理后回輸CAR-T細(xì)胞至患者體內(nèi)；監(jiān)控，觀(guān)察療效并嚴(yán)密監(jiān)測(cè)不良反應(yīng)。整個(gè)療程持續(xù)3周左右，其中細(xì)胞“分離-修飾-擴(kuò)增”約需要2周。

CAR-T的結(jié)構(gòu)

CAR通常由一個(gè)胞外抗原結(jié)合域（如識(shí)別CD19的單鏈抗體序列scFv），一個(gè)鉸鏈區(qū)（促進(jìn)抗原受體與腫瘤抗原的結(jié)合），一個(gè)跨膜區(qū)（用來(lái)固定CAR），一個(gè)T細(xì)胞激活結(jié)構(gòu)域（CD3ζ，提供T細(xì)胞活化的第一信號(hào)）以及一個(gè)或多個(gè)胞內(nèi)共刺激結(jié)構(gòu)域組成（CD28/4-1BB，提供T細(xì)胞活化的第二信號(hào)）。CAR的胞外抗原結(jié)合域源于抗體的抗原結(jié)合基序，可以連接VH和VL序列構(gòu)建的單鏈可變區(qū)，具有特異性識(shí)別某種特定腫瘤相關(guān)抗原的作用。CAR識(shí)別腫瘤相關(guān)抗原，隨后通過(guò)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域活化T細(xì)胞，刺激T細(xì)胞進(jìn)行增殖，并發(fā)揮免疫效應(yīng)，釋放細(xì)胞因子，溶解腫瘤細(xì)胞。

歷經(jīng)十余年，CAR-T經(jīng)歷了四代結(jié)構(gòu)，每一代結(jié)構(gòu)在各個(gè)細(xì)節(jié)上均有所突破，使CAR-T往更為精準(zhǔn)、更為高效、更為持久的方向發(fā)展。T細(xì)胞的完全激活一方面依賴(lài)于胞外抗原結(jié)合域與抗原的結(jié)合所傳遞的第一信號(hào)，另一方面也需要共刺激分子受體與其配體結(jié)合所傳遞的第二信號(hào)，而腫瘤細(xì)胞表面通常不表達(dá)這類(lèi)共刺激配體。第一代CAR設(shè)計(jì)結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單，在臨床試驗(yàn)中的效果并不理想。第二代CAR引入一個(gè)共刺激結(jié)構(gòu)域CD28或4-1BB，在臨床試驗(yàn)中顯著改善了CAR-T免疫活性激活的問(wèn)題，并提高了作用持久性。第三代CAR包含兩個(gè)共刺激結(jié)構(gòu)域，一個(gè)為CD28或4-1BB，另一個(gè)為OX40、CD28或4-1BB。相比二代，三代CAR雖然在一些前臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)中表現(xiàn)出更強(qiáng)、更持久的作用活性，但也有報(bào)道指出，三代CAR可能會(huì)造成T細(xì)胞刺激閾值的降低，引起信號(hào)泄露，可能誘發(fā)細(xì)胞因子過(guò)量釋放。

由于腫瘤細(xì)胞具有異質(zhì)性，一部分腫瘤細(xì)胞不具有可被T細(xì)胞特異性識(shí)別的抗原，無(wú)法被傳統(tǒng)的CAR-T細(xì)胞識(shí)別并清除。這一問(wèn)題或可通過(guò)四代CAR-T技術(shù)，募集除T細(xì)胞以外的免疫細(xì)胞至腫瘤所在區(qū)域來(lái)解決。四代CAR-T細(xì)胞又被稱(chēng)為T(mén)RUCK T細(xì)胞，含有一個(gè)活化T細(xì)胞核因子（NFAT）轉(zhuǎn)錄相應(yīng)元件，可以使CAR-T細(xì)胞在腫瘤區(qū)域分泌特定的細(xì)胞因子（目前主要是IL-12），從而修飾腫瘤微環(huán)境，募集并活化其他免疫細(xì)胞進(jìn)行免疫反應(yīng)。目前，四代CAR-T療法已經(jīng)在包括神經(jīng)母細(xì)胞瘤在內(nèi)的實(shí)體瘤中開(kāi)展臨床試驗(yàn)。

第二代CAR-T有較多的臨床數(shù)據(jù)支持，穩(wěn)定性高且技術(shù)工藝較為成熟，是目前的主流技術(shù)。未來(lái)，隨著新結(jié)構(gòu)在臨床上的試驗(yàn)推廣及生產(chǎn)工藝的改進(jìn)，第三代、第四代CAR-T產(chǎn)品更為優(yōu)良的療效值得期待。

CAR-T的靶向抗原

CAR-T技術(shù)是靶向某一種抗原，而不是針對(duì)單一腫瘤疾病，因此靶點(diǎn)的選擇是CAR-T有效性和安全性的基礎(chǔ)。CAR-T靶向的腫瘤抗原可分為兩類(lèi)：一類(lèi)是腫瘤特異性抗原，是最理想的抗原。靶點(diǎn)抗原的特異性越高，CAR-T細(xì)胞就可越專(zhuān)一地針對(duì)特定的腫瘤細(xì)胞，對(duì)正常細(xì)胞不作用，從而降低不良反應(yīng)。但這種理想的抗原不多，目前受到關(guān)注的有表皮生長(zhǎng)因子受體EFGRvIII和前列腺特異性膜抗原PSMA等。還有一類(lèi)是腫瘤相關(guān)抗原，其在腫瘤細(xì)胞表面過(guò)度表達(dá)，在正常組織中低表達(dá)，目前大部分應(yīng)用的腫瘤抗原靶點(diǎn)都是這種。

目前應(yīng)用于臨床最成功的案例是以CD19為靶點(diǎn)構(gòu)建的CAR-T，但其適應(yīng)證局限在B細(xì)胞相關(guān)的血液腫瘤中，如B系淋巴細(xì)胞白血病（急性、慢性）以及非霍奇金淋巴瘤（彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、套細(xì)胞淋巴瘤等）。

據(jù)Cell Trials的統(tǒng)計(jì)，截至2017年10月，全球大約50%的CAR-T臨床試驗(yàn)針對(duì)CD19靶向抗原，另有一小部分（約6%）使用的是由CD19與另一抗原組成的組合抗原。除了CD19，CAR-T在血液腫瘤治療方面還有許多其他抗原，其中BCMA、CD22、CD20較為常見(jiàn)。BCMA正在成為CAR-T治療的熱門(mén)靶點(diǎn)。

2018年中國(guó)腫瘤登記年報(bào)數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)發(fā)病率最高的前10種癌癥均為實(shí)體瘤，占全部癌癥的比例高達(dá)77%。但實(shí)體瘤靶點(diǎn)的研發(fā)較為困難，相關(guān)研發(fā)任重道遠(yuǎn)。目前針對(duì)實(shí)體瘤，以間皮素為靶點(diǎn)的CAR-T臨床試驗(yàn)數(shù)量最多，針對(duì)磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（GPC3）靶點(diǎn)治療肝癌、雙唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂2（GD2）靶點(diǎn)治療神經(jīng)母細(xì)胞瘤以及針對(duì)CEA靶點(diǎn)治療腸癌的CAR-T療法也受到了廣泛關(guān)注。

CAR-T結(jié)構(gòu)中抗體scFv的篩選

CAR是以抗體的scFv（單鏈可變區(qū)）識(shí)別腫瘤抗原的，所以CAR-T的研發(fā)需要獲取和篩選單抗。篩選出親和力高的單抗后，將相應(yīng)的雜交瘤細(xì)胞凍存?zhèn)鞔纬煞€(wěn)定的細(xì)胞株，用于CAR結(jié)構(gòu)中scFv序列的構(gòu)建。

scFv由重鏈、輕鏈以及之間的linker連接而成，所以將不同的重鏈和輕鏈隨機(jī)組合，可以建成人源化的scFv組合抗體文庫(kù)，再通過(guò)表達(dá)量、穩(wěn)定性、與抗原的親和力等指標(biāo)進(jìn)行篩選。高通量篩選主要通過(guò)噬菌體展示技術(shù)。該技術(shù)最大的優(yōu)點(diǎn)是直接將表達(dá)出來(lái)的抗體與其基因型聯(lián)系在一起，再利用抗原-抗體的特異性結(jié)合，將感興趣的抗體挑選出來(lái)。通過(guò)噬菌體技術(shù)，可高效獲得scFv人源化片段，提高CAR-T的安全性和有效性。

scFv序列是CAR-T研發(fā)中的核心技術(shù)，從華創(chuàng)證券的調(diào)研信息來(lái)看，篩選一個(gè)合適的scFv序列，時(shí)間成本和費(fèi)用成本都不低，鼠源性的成本在幾十萬(wàn)元，人源化的則需要上百萬(wàn)元。目前很多科研機(jī)構(gòu)使用的序列是從文獻(xiàn)上獲取的，原則上只能用于科研。所以如果要做創(chuàng)新型CAR-T并進(jìn)行商業(yè)化，則需要科研機(jī)構(gòu)或企業(yè)自主研發(fā)篩選。

CAR-T的轉(zhuǎn)染載體與制備工藝

為實(shí)現(xiàn)CAR在T細(xì)胞上的表達(dá)，需要通過(guò)載體將CAR基因?qū)隩細(xì)胞。理想的載體應(yīng)該具有較高的基因轉(zhuǎn)染效率、穩(wěn)定性好，不引起機(jī)體免疫反應(yīng)等特點(diǎn)。目前有多種載體用于CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品制備，包括病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)（如γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或慢病毒載體）及非病毒載體轉(zhuǎn)染（如轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)染、mRNA電穿孔轉(zhuǎn)染）等，雖然已開(kāi)展的臨床試驗(yàn)以病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)方式為主，但以非病毒載體轉(zhuǎn)染的方式也在獲得青睞。

慢病毒載體是目前應(yīng)用最多的載體系統(tǒng)。病毒基因轉(zhuǎn)移載體的主要優(yōu)點(diǎn)是制造、生產(chǎn)相對(duì)容易，并且能夠?qū)⑦z傳物質(zhì)穩(wěn)定整合到宿主基因組中。但病毒載體的致病性和潛在的插入誘變可能性在人類(lèi)臨床試驗(yàn)中存在顯著的監(jiān)管障礙，所以非病毒載體的開(kāi)發(fā)顯得十分重要。轉(zhuǎn)座子和mRNA電穿孔技術(shù)是目前研究比較多的兩類(lèi)非病毒載體系統(tǒng)。轉(zhuǎn)座子最終可能發(fā)展成多功能T細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，但目前的DNA電穿孔方法通常產(chǎn)生較差的細(xì)胞活力，臨床應(yīng)用中需要擴(kuò)大T細(xì)胞培養(yǎng)，以產(chǎn)生大量 T 細(xì)胞。mRNA電穿孔被認(rèn)為是目前最安全的T細(xì)胞基因轉(zhuǎn)導(dǎo)方法，其可轉(zhuǎn)導(dǎo)靜止或增殖緩慢的T細(xì)胞，轉(zhuǎn)導(dǎo)效率多在90%以上，且設(shè)計(jì)相對(duì)容易，性?xún)r(jià)比高。臨床上已經(jīng)使用利用瞬時(shí)mRNA轉(zhuǎn)染產(chǎn)生的CAR-T細(xì)胞，然而，這種方法需要幾輪CAR-T細(xì)胞輸注。在臨床前模型中，mRNA電穿孔轉(zhuǎn)導(dǎo)的靶向間皮素的CAR-T能引起播散性間皮瘤異種移植物的消退，然而，在灌輸49天后一名患者出現(xiàn)了過(guò)敏反應(yīng)。

CAR-T細(xì)胞的制備需要一些小心操作的步驟，而且整個(gè)過(guò)程中都需進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)控測(cè)試。CAR-T的GMP制備工藝主要包括：T細(xì)胞收集和分離、T細(xì)胞激活和修飾、T細(xì)胞擴(kuò)增、T細(xì)胞收獲與回輸。生產(chǎn)過(guò)程通常需要5～10天，從收集到回輸需要2～4周（根據(jù)患者的臨床狀態(tài)和化療預(yù)處理方案確定）。

CAR-T細(xì)胞制造是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程，制造難、成本高已經(jīng)成為行業(yè)發(fā)展的瓶頸問(wèn)題。目前，吉利德和諾華公司均采用的是集中生產(chǎn)模式，首先在醫(yī)院中提取患者的T細(xì)胞，然后將這些細(xì)胞運(yùn)送至制造中心，在制造中心對(duì)T細(xì)胞進(jìn)行基因工程設(shè)計(jì)，最后將設(shè)計(jì)后的T細(xì)胞運(yùn)回醫(yī)院回輸至患者體內(nèi)。然而，無(wú)論使用何種制造模式，成功的CAR-T細(xì)胞制造都依賴(lài)于端到端流程的優(yōu)化能力，包括工作流程的簡(jiǎn)化、產(chǎn)能規(guī)劃以及生產(chǎn)的可擴(kuò)展性等等。自動(dòng)化、全封閉的新一代制造工藝是未來(lái)發(fā)展趨勢(shì)，目前市場(chǎng)上已經(jīng)有一些解決方案，如博雅控股集團(tuán)旗下的CAR-TXpress、美天旎的CliniMACS Prodigy以及GE公司的FlexFactory 等。（木子鵬）